Barnaba urodził się na Cyprze w rodzinie żydowskiej z pokolenia Lewiego. Pierwotnie nazywał się Józef – imię pod którym wszedł do historii Kościoła nadali mu apostołowie. Według świadectw Klemensa Aleksandryjskiego i Euzebiusza Barnaba był krewnym św. Marka Ewangelisty i należał do grona siedemdziesięciu dwóch uczniów Jezusa. Jako syn właścicieli ziemskich był człowiekiem majętnym, jednak sprzedał całą swoją posiadłość, aby uzyskane w ten sposób pieniądze przekazać św. Piotrowi na działalność wspólnoty wyznawców Chrystusa.

Barnaba jest najbardziej znany jako jeden ze współpracowników św. Pawła, który po swoim nawróceniu, zwrócił się właśnie do Barnaby, aby był pośrednikiem między nim a apostołami. Paweł zabrał też Barnabę wraz z Markiem jako towarzyszy jego pierwszej podróży apostolskiej. Kiedy Ewangelista opuścił ich samowolnie, Apostoł Narodów stanowczo sprzeciwił się jego udziałowi w drugiej podróży misyjnej, co spowodowało konflikt między Pawłem i Barnabą. Ostatecznie dwaj towarzysze Pawła wrócili na Cypr, gdzie Barnaba kontynuował głoszenie Ewangelii. Według tradycji został on pierwszym biskupem tej wyspy. Tam też, a dokładnie w Salaminie, miał ponieść śmierć męczeńską przez ukamienowanie w 61 roku.

Tradycja głosi, że w 488 roku odnaleziono jego ciało, ze złożoną na piersiach Ewangelią św. Mateusza, którą miał własnoręcznie przepisać. Jego relikwie można znaleźć w wielu miastach włoskich, a także m.in. w Kolonii, Pradze i Tuluzie.

W ikonografii św. Barnaba przedstawiany jest z kijem pielgrzymim, kamieniem, księgą, lub gałązką oliwną – symbolem męczeństwa. Jest patronem tkaczy i bednarzy.